VÝVOJ PYLU: OD MIKROSPOROCYTU KE ZRALÉMU PYLOVÉMU ZRNU


Obr. 1: Otevřený prašník Mimosa sp. se zralými pylovými zrny zobrazený pomocí skenovací elektronové mikroskopie.

Pro životní cyklus rostlin je charakteristické střídání haploidní (gametofytické) a diploidní (sporofytické) generace. Ve vývojové linii cévnatých rostlin je patrná tendence k redukci gametofytu a k jeho stále větší funkční závislosti na sporofytu. U vývojově nejpokročilejších rostlin krytosemenných, jež v současnosti se svými více než 280 000 druhy představují naprostou většinu rostlinných druhů, dosáhla redukce gametofytu svého maxima. Právě ta je spolu s dokonalou ochranou reprodukčních orgánů a využíváním mechanismů výběru životaschopnějšího pylu považována za hlavní příčinu jejich evolučního úspěchu. Většina krytosemenných rostlin vytváří oboupohlavné květy obsahující prašníky i pestíky, kde vznikají a vyvíjejí se samčí i samičí gametofyty.

Obě struktury – pylové zrno i zárodečný vak – jsou mikroskopické, sestávající jen z několika málo buněk, a jsou naprosto neschopné vývoje bez podpory okolního sporofytu. Jediným obdobím, kdy se gametofyt semenných rostlin, a to pouze samčí, vyskytuje samostatně, je stadium zralého pylu po opuštění prašníku během svého přenosu na bliznu. Samčí gametofyt představuje zejména ve srovnání se sporofytem jednoduchý a vysoce redukovaný systém, který tak poskytuje unikátní příležitost ke studiu vývojové regulace na mnoha úrovních a také funkčních interakcí mezi různými typy buněk. Právě vývoji samčího gametofytu předurčujícího jej k jeho unikátní roli bude věnován tento příspěvek.

Pylové zrno představuje vysoce redukovanou, dvoj- nebo tříbuněčnou strukturu uzpůsobenou k produkci dvou spermatických buněk a jejich dopravení k samičímu gametofytu, zárodečnému vaku, kde dojde k dvojitému oplození. Diploidní mateřské buňky mikrospor (mikrosporocyty) se nacházejí v prašnících, v prašných pouzdrech obklopených čtyřmi buněčnými vrstvami – tapetem, střední vrstvou, endotheciem a epidermis. Zde mikrosporocyty sekretují unikátní buněčnou stěnu sestávající z β-1,3-glukanu, kalózy, a poté se během dvou meiotických dělení rozdělí ve čtyři haploidní mikrospory tvořící tetrádu (obr. 2). Mateřské buňky mikrospor navzájem komunikují prostřednictvím cytoplazmatických můstků, což umožňuje synchronizaci jednotlivých meiotických dělení v celém prašníku. II. meiotické dělení je následováno syntézou kalózových stěn také mezi jednotlivými mikrosporami v tetrádě.

V době meiotického dělení mikrosporocytů se buňky tapeta diferencují v dvojjaderné polární sekreční buňky postrádající primární buněčnou stěnu, především v místě kontaktu s prašnými pouzdry. Tyto buňky obsahují výjimečné množství ribozomů, mitochondrií, endoplazmatického retikula, Golgiho aparátu a konečně i specializovaných organel bohatých lipidy, tapetozomů, a to zejména v blízkosti plazmatické membrány hraničící s prašnými pouzdry. I buňky tapeta jsou propojeny cytoplazmatickými můstky, což umožňuje koordinaci jejich aktivit. Recentní studie transkriptomů pletiv prašníků různých rostlinných druhů ukázaly precizní kontrolu aktivity a následné programované buněčné smrti buněk tapeta a koordinaci těchto procesů s vývojem pylu.


Obr. 2: Schematický diagram znázorňující vývoj samčího gametofytu.

Mladé mikrospory v tetrádách podstupují bouřlivý vývoj doprovázený syntézou buněčné stěny sestávající z vnitřní intiny a vnější exiny. Po vytvoření částečně zformované exiny jsou mikrospory z tetrád uvolněny. K tomu dochází díky aktivitě směsi enzymů sekretovaných buňkami tapeta, jejíž zásadní složkou je kaláza (β-1,3-glukanáza) zodpovědná za rozpouštění kalózy. Správné načasování sekrece kalázy je jedním z kritických momentů mikrosporogeneze a jeho narušení je jednou z příčin pylové samčí sterility. Volné mikrospory rychle nabývají na velikosti a obsahují větší množství malých vakuol (obr. 2). Tyto časem splývají v jedinou velkou vakuolu vyplňující většinu objemu mikrospory, jejíž přítomnost bývá spojována s přesunem původně centrálně uloženého jádra na přesně určené místo na periferii buňky. Samotný proces přesunu není pasivním jevem jen v důsledku růstu vakuoly, ale procesem dynamickým vyžadujícím aktivní účast mikrotubulů.

V tomto období také dochází k dokončení tvorby buněčné stěny syntézou intiny. Buňky tapeta jsou během mikrosporogeneze mimořádně metabolicky aktivní. Sekretují do prostoru prašných pouzder množství bílkovin, lipidů, sacharidů a sekundárních metabolitů, které jsou využívány vyvíjejícími se mikrosporami k syntéze membrán, tvorbě exiny a v neposlední řadě jako zdroj energie. Přes tuto zjevnou důležitost tapeta lze dosáhnout správného dozrání funkčního pylu v podmínkách in vitro již od pozdějších vývojových stadií mikrospor, pochopitelně za přítomnosti základních živin.

Mikrospory s jádrem umístěným u stěny podstupují výrazně asymetrické dělení, I. haploidní či pylovou mitózu (PMI, obr. 2). Výsledkem tohoto dělení jsou dvě značně nestejné buňky, buňka vegetativní a generativní, přičemž obě se vyskytují v prostoru ohraničeném původní buněčnou stěnou mikrospory a generativní buňka je posléze zcela pohlcena svou vegetativní sestrou. Z terminologického hlediska také celý systém v tomto okamžiku přestává být mikrosporou a stává se nezralým pylovým zrnem, nicméně si musíme přiznat, že terminologie je zde natolik komplikovaná a často nejen v různých jazycích různá a neustálená, že její rozbor by vydal na samostatný článek. I. pylová mitóza však nade vši pochybnost představuje kritický moment ve vývoji samčího gametofytu, jeho hlavní zlomový bod spočívající v potvrzení nastoupeného gametofytického vývojového programu, jak prokázalo studium populací RNA a bílkovin. Generativní buňka také tvoří základ samčí zárodečné linie; ta tedy vzniká v každém jednom samčím gametofytu nezávisle a je na rozdíl od živočichů derivátem vegetativních pletiv. Samčí zárodečná linie však u rostlin nemá dlouhého trvání (zahrnuje vlastně jediné mitotické dělení) a končí dvojitým oplozením. Zvrácení gametofytického vývojového programu na sporofytický je mnohem jednodušší a také častější u jednobuněčných mikrospor než u dvojbuněčných pylových zrn. Po skončení PMI jsou exprimovány pozdní pylově specifické geny a jejich aktivace již způsobuje nezvratnost gametofytické cesty. V případě narušení asymetričnosti mitotického dělení, ať už centrifugací, pomocí látek inhibujících formování mikrotubulů, např. kolchicinu, či mutací genů zodpovědných v mikrosporách za organizaci a orientaci pole mikrotubulů, dojde k vytvoření dvou podobných buněk vykazujících charakteristiky vegetativní buňky. Takovými geny jsou u huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana) GEMINI1 (GEM1) kódující bílkovinu asociovanou s mikrotubuly MOR1/GEM1 a jeho tabákový ortolog kódující protein TMBP200. Tím bylo prokázáno, že buněčný osud vegetativní buňky představuje výchozí stav, zatímco asymetričnost PMI je nutnou podmínkou pro následnou indukci samčí zárodečné linie. Všechny tyto skutečnosti ukazují na nezastupitelnou roli asymetrického dělení pro určení dalšího osudu obou dceřiných buněk.

Vegetativní buňka mladého pylového zrna se vyznačuje hustou cytoplazmou s množstvím organel a zásobních látek, mezi nimiž nalezneme i RNA a bílkoviny. Generativní buňka naproti tomu dědí z mikrospory jen velmi malou část cytoplazmy a organel. Zatímco jádro generativní buňky obsahuje vysoce kondenzovaný chromatin, vegetativní jádro setrvávající v G1 fázi buněčného cyklu a obsahující dekondenzovaný chromatin je větší s vyšším množstvím pórů. I na základě této skutečnosti se usuzovalo na daleko větší transkripční aktivitu vegetativního jádra ve srovnání s jádrem generativní buňky. Globální expresní studie však ukázaly, že ani ta rozhodně není zanedbatelná, ba naopak, míra genové exprese generativní buňky a z ní vzniklých samčích gamet je směle srovnatelná s buňkou vegetativní. Aktivita velkého množství popsaných genů však stále čeká na své odhalení. Vyvíjející se mladé pylové zrno se také vyznačuje značnou metabolickou aktivitou; v období od I. pylové mitózy do stadia plné zralosti se jeho objem zvětšuje dvakrát, obsah celkové RNA stoupá sedmkrát a obsah mRNA dokonce třináct- až dvacetkrát. Vegetativní buňka mimoto akumuluje značné množství sacharidových, lipidových i proteinových rezerv stejně jako další metabolity (polyaminy, flavonoidy) důležité pro jinak nepříliš výraznou schopnost pylu vyrovnávat se s nepříznivými podmínkami vnějšího prostředí a v neposlední řadě i pro rychlý růst pylové láčky.


Obr. 3: Dvojbuněčný a trojbuněčný pyl. A, B: dvojbuněčný pyl tabáku viržinského (Nicotiana tabacum); C, D: trojbuněčný pyl bezu černého (Sambucus nigra) zobrazený pomocí světelné (A, C) a fluorescenční (B, D) mikroskopie. Jaderná DNA ve vegetativní (V), generativní (G) a spermatických (S) buňkách je označena popisky.

Obr. 4: „Male germ unit“ (MGU) dvojbuněčného a trojbuněčného pylu. Vysvětlení a detaily v textu.

Závěrečnou fází dozrávání pylového zrna je jeho dehydratace. Ve zralém pylu v době antheze rapidně klesá obsah vody až na hodnoty v rozmezí méně než 6 % (topol) až 35 % a více (trávy). Stupeň dehydratace má pravděpodobně vztah k životaschopnosti pylu po uvolnění z prašníku. Pyl tykve obecné, který naproti tomu neprochází dehydratační fází, si po anthezi zachovává svou životaschopnost jen po velice krátkou dobu. Míra dehydratace pylového zrna souvisí mimo jiné s přítomností osmoprotektantů, např. disacharidů, prolinu a glycinbetainu, chránících zejména buněčné membrány a bílkoviny před poškozením.

Generativní buňka podstupuje ještě jedno mitotické dělení, II. haploidní či pylovou mitózu (PMII), na jejímž konci jsou dvě samčí gamety, první a druhá buňka spermatická. Podle časování PMII před nebo až po vyklíčení pylového zrna sestává zralý pyl ze dvou nebo tří buněk (obr. 3), buňky vegetativní a generativní (dvojjaderný pyl), anebo buňky vegetativní a dvou buněk spermatických (trojjaderný pyl). Dvojjaderný typ pylu, který je podle některých teorií považován za evolučně starší, se vyskytuje u přibližně 70 % druhů krytosemenných rostlin napříč systémem, což ukazuje, že trojbuněčný pyl se během evoluce objevil několikrát nezávisle na sobě. Zajímavostí je, že u některých bazálních krytosemenných rostlin (např. rodů Annona či Magnolia) koexistují oba typy pylu, dvojjaderný i trojjaderný, v jednom prašníku a poměr mezi nimi závisí na teplotě, které je květ při zrání pylu vystaven. Vegetativní jádro zůstává v těsné fyzické vazbě s oběma buňkami spermatickými i po ukončení PMII. Zmíněný komplex se anglicky nazývá „male germ unit“ (MGU, obr. 4) a zastává naprosto zásadní úlohu nejen při dopravě spermatických buněk k vajíčku, ale zejména v přímé komunikaci mezi buňkami a jejich jádry náležejícími k somatické a zárodečné linii a snad i v regulaci jejich genové exprese.

Po dopadu na bliznu se pyl rehydratuje, aktivuje, zcela přestavuje expresi svého genomu a brzy se na jeho povrchu v místě jednoho z pórů v exině objevuje vegetativní buňka přetvořená v pylovou láčku. Pylová láčka roste vodicím pletivem čnělky směrem k mikropyle vajíčka a nese vegetativní jádro a obě spermatické buňky ve své špičce. To je ovšem již zcela jiný příběh, kterému se budeme věnovat v některém z následujících čísel.

Autoři:
doc. RNDr. David Honys, Ph.D. (Ústav experimentální botaniky AV ČR; david@ueb.cas.cz) a Ing. Barbora Honysová (Gennet s. r. o.; bara.honysova@gmail.com)

Autorka obrázků: B. Honysová

• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •