MORAVSKÁ STOPA VE VÝZKUMU DĚDIČNOSTI


Obr. 1: Semenáčky pšenice připravené pro synchronizaci buněčného cyklu v kořenových meristémech.


Obr. 2: Semenáčky pšenice, jejichž kořínky jsou postupně inkubovány v roztocích, pomocí kterých je dosaženo vysokého stupně synchronizace buněčného dělení v meristému kořenové špičky. To je podmínkou pro izolaci velkého množství chromozomů potřebného pro třídění pomocí průtokové cytometrie.

Sotva kdy by si před 150 lety dokázal opat augustiniánského kláštera v Brně Gregor Mendel, který tehdy poprvé zveřejnil výsledky svého bádání o zákonitostech dědičnosti, představit, že na jeho práci naváží o mnoho let později v dalším moravském městě, v Olomouci. Právě tam existuje pracoviště, které má jako jediné na světě tým zabývající se chromozomovou genomikou a kterému se podařilo vyvinout unikátní metodu izolace chromozomů. Podívejme se ale nejprve na to, v čem spočívá složitost analýzy dědičné informace rostlin a kde najdeme onu moravskou stopu.

Gregor Johann Mendel na rozdíl od tehdy všeobecně přijímané představy o mísení vloh dokázal, že u hybridů (kříženců) zůstávají vlohy získané od každého z rodičů oddělené a náhodně se přenášejí do potomstva. Každý z potomků tak získává unikátní kombinaci mateřských a otcovských vloh a jejich sestavou se liší od rodičů i sourozenců. I když se určitá vloha u potomka neprojeví, například díky dominanci vlohy získané od druhého z rodičů, může se projevit až v další generaci. Pro Mendelovy následovníky nebylo vůbec jednoduché přijít na to, kde se faktory podmiňující tyto vlohy v buňce nacházejí a jaká je jejich materiální podstata. Mendelovy objevy byly z tohoto důvodu potvrzeny až počátkem 20. století. Tehdy vědci zjistili, že chování chromozomů v průběhu buněčného dělení a tvorby pohlavních buněk odpovídá Mendelovým zákonům. Rodičovské chromozomy somatických buněk (mající dvě sady chromozomů) se totiž do pohlavních buněk (majících jednu sadu chromozomů) rozcházejí náhodně, ale při zachování počtu chromozomů v sadě.

K tomuto závěru dospěli nezávisle na sobě dva badatelé, německý vědec Theodor Boveri a americký doktorand Walter Sutton, kteří jsou považováni za autory chromozomové teorie dědičnosti. Jejich teorii potvrdil v roce 1915 Američan Thomas Hunt Morgan. Následovalo padesátileté období, během kterého vědci pokračovali ve výzkumu dědičnosti. Jako nositele identifikovali molekulu DNA a nakonec rozluštili i genetický kód. To, společně s mnoha objevy na poli molekulární biologie, otevřelo cestu ke čtení úplné genetické informace (genomu) různých organismů.

Díky obrovskému pokroku v technologiích sekvenování DNA byla do dnešní doby přečtena dědičná informace mnoha druhů mikroorganismů, živočichů a rostlin. Pracovní verze lidského genomu, který tvoří asi tři miliardy písmen dědičného kódu, bází DNA, byla publikována již v roce 2001. Od poloviny devadesátých let 20. století se postupně etabloval nový vědní obor, genomika, jehož cílem je popsat celou dědičnou informaci organismu a vysvětlit její funkci. Genomika přináší nové poznatky a nečekané objevy. Odhaluje strukturu dědičné informace a změny, které doprovázely její evoluci, včetně zásadní role polyploidizace (duplikace celých genomů) u rostlin, někdy doprovázené mezidruhovou hybridizací.

Znalost dědičné informace otevírá možnosti pro podrobné studium její funkce, identifikaci jednotlivých genů a regulačních oblastí odpovídajících za růst a vývoj organismu. Sekvence genomu umožňuje odhalovat molekulární podstatu tzv. epigenetické dědičnosti, která se neřídí Mendelovými zákony a která je podmíněná modifikacemi bází DNA. Více se o problému můžete dočíst v článku „Netušená evoluční síla rodičů“, publikovaném v časopise Botanika 2013/1. Podrobná znalost genomu je neocenitelná při studiu fylogeneze a vzniku druhů. Stejně významné jsou praktické dopady tohoto pokroku. Šlechtitelé stále častěji využívají molekulární metody a zejména DNA markery, pomocí kterých již v raných fázích růstu identifikují žádané potomky křížení. A to je důležité, protože tak mohou výrazně zkrátit šlechtitelský cyklus. Klesající ceny sekvenování a rostoucí kapacita sekvenátorů umožňují analyzovat genomy celých populací. Je tak například možné identifikovat oblasti genomu, které odpovídají za určité vlastnosti organismu. Stejně tak je možné definovat tzv. pan-genom, jako soubor všech sekvencí vyskytujících se v daném druhu, nikoliv však v každém z jeho příslušníků. Díky tomu už víme, že se my, jako příslušníci lidského rodu, můžeme navzájem lišit až stovkami genů a milióny písmen genetické informace.


Obr. 3: Vysokorychlostní průtokový cytometr a sorter BD FACSAria používaný pro třídění chromozomů rostlin.


I když je genom rozdělen na chromozomy, které tvoří jeho menší a dobře definované části, v podstatě všechny projekty sekvenují veškerou jadernou DNA, tedy všechny chromozomy dohromady. Protože však současné metody sekvenování umožňují číst jen krátké úseky DNA, je před sekvenováním nutné molekuly DNA naštípat na malé fragmenty. Výsledkem sekvenování je pak velký soubor malých částí dědičné informace (typicky několik set bází). Pomocí bioinformatických metod a genetického mapování jsou potom tyto úseky spojovány, přičleňovány k jednotlivým chromozomům a uspořádávány tak, aby to odpovídalo jejich skutečnému pořadí. Tento přístup je relativně bezproblémový u organismů s menšími genomy o velikosti do několika set milionů bází DNA.

A samozřejmě v případech, kdy už referenční sekvenci máme, jako je tomu u člověka, a pomocí ní uspořádáváme přečtené malé úseky získané u jiných příslušníků stejného druhu (tzv. resekvenování). Pokud tomu tak není, je s rostoucí velikostí genomu sestavování krátkých úseků do větších celků obtížnější a výsledná sekvence genomu může být zatížena mnoha chybami. Důvodem je, že se genomy eukaryot v průběhu evoluce zvětšovaly především navyšováním množství různých typů opakujících se (repetitivních) sekvencí DNA a nikoliv nárůstem počtu genů. Velikost genomů se samozřejmě zvětšovala také polyploidizací. Oboje má za následek zvětšení počtu stejných či velmi podobných úseků DNA v genomu. Určování polohy takových sekvencí a jejich sestavování do větších celků je velmi obtížné, a to je také jeden z důvodů, proč počet sekvenovaných genomů klesá s jejich velikostí a proč nemáme kvalitní genomové sekvence druhů s genomy o velikosti více než několik miliard bází DNA.


Obr. 4: Detail průtokové komůrky cytometru BD FACSAria. V komůrce jsou měřené chromozomy usměrňovány tak, aby se pohybovaly jeden za druhým a jejich optické parametry mohly být jednotlivě hodnoceny.

Problém sestavování sekvencí velkých genomů by se samozřejmě zjednodušil, pokud bychom využili toho, že se genomy skládají z chromozomů a každý z nich bychom sekvenovali odděleně. Jako příklad můžeme použít genom pšenice seté. Tento druh vznikl postupnou hybridizací tří planých druhů trav, přičemž každý z nich měl dědičnou informaci rozloženou na sedmi chromozomech. Hybridizace byla doprovázena polyploidizací a výsledkem je hexaploidní pšenice, která od každého z rodičů získala sedm párů chromozomů. Celkem má tedy šest × sedm, tedy čtyřicet dva chromozomy. Chromozomy jsou v párech a dědičná informace pšenice je tedy fakticky rozložena na 21 chromozomech.

Postupné sekvenování jednotlivých chromozomů nabízí oproti celogenomové metodě několik výhod.

Především je to značné zjednodušení složitosti vzorku DNA. Pokud zůstaneme u pšenice seté, namísto sedmnácti miliard písmen genetické informace sekvenujeme a sestavujeme méně než jednu miliardu. Tato strategie také usnadňuje spolupráci na velkých projektech. Členové Mezinárodního konsorcia pro sekvenování genomu pšenice si 21 chromozomů této plodiny mezi sebou rozdělili a většina z nich sekvenuje pouze jeden chromozom, nebo dokonce jen jedno jeho raménko. Členové konsorcia si své projekty hradí z dotací získaných od místních grantových agentur a jiných sponzorů, takže nebylo nutné mít při zahájení projektu k dispozici jeden obrovský balík peněz.

Sekvenování jednotlivých chromozomů namísto celých genomů se neuplatňuje jen při prvotním sekvenování genomů a získávání kvalitních referenčních sekvencí, ale také například při hledání DNA markerů pro určitý znak. V tomto případě je sekvenován stejný chromozom izolovaný ze dvou linií lišících se v daném znaku. Výhoda spočívá v tom, že není třeba sekvenovat celé genomy obou linií, ale jen jejich menší části. To je samozřejmě možné za podmínky, že víme, na kterém chromozomu se gen podmiňující tento znak nachází. Významnou aplikací chromozomové genomiky je analýza molekulární struktury a evoluce specializovaných chromozomů, jako jsou například pohlavní chromozomy a tzv. B chromozomy, které se vyskytují jen u některých druhů živočichů a rostlin. Jejich původ ani biologický význam nejsou jasné a většina badatelů je považuje za parazitické elementy dědičné informace. Protože se oba typy chromozomů v genomu vyskytují společně s ostatními chromozomy, celogenomové sekvenování neumožňuje snadnou identifikaci sekvencí pocházejících z těchto chromozomů. Izolace specializovaných chromozomů naopak nabízí snadnější cestu k jejich sekvencím.


Obr. 5: Robotické zařízení používané pro automatický sběr kolonií bakterií nesoucích krátké úseky DNA pšenice. Robot ukládá jednotlivé kolonie do mikrotitračních destiček s 384 jamkami.


Obr. 6: Mikrotitrační destičky s klony bakterií nesoucími krátké úseky DNA pšenice jsou dlouhodobě uchovávány při −80 °C.

Chromozomová genomika je atraktivní pro mnoho aplikací a projektů. Ale ani v tomto případě nic není zadarmo. Zatímco celogenomové sekvenování si na začátku vystačí s genomovou DNA, kterou lze snadno izolovat, při sekvenování chromozomů musíme být schopni požadovaný chromozom odlišit od ostatních chromozomů daného organismu a v potřebném počtu ho izolovat. Toho je schopna pouze průtoková cytometrie, která rychlostí tisíců částic za vteřinu analyzuje optické parametry jednotlivých chromozomů (typicky fluorescenci a schopnost rozptylovat světlo), a to během jejich pohybu v úzkém vodním paprsku. Vlastní izolace vybraného typu chromozomu se děje roztřepáváním vodního paprsku unášejícího chromozomy na mikrokapky a odchylováním mikrokapek obsahujících vybraný chromozom do sběrné zkumavky. Součástí tohoto procesu je kontrola, zda cytometr třídí požadovaný chromozom a zda není tříděná frakce kontaminovaná jinými chromozomy. To je možné udělat např. vytříděním asi tisíce chromozomů na mikroskopické sklíčko a hodnocením tříděné populace ve fluorescenčním mikroskopu. (Více o průtokové cytometrii se je možné dočíst v článku „Co všechno nám mohou říci cytometrické analýzy“ v časopise Botanika 2014/1.)

Průtoková cytometrie vyžaduje vzorky ve formě vodní suspenze milionů mechanicky nepoškozených chromozomů. Jenže většina buněk rostlinného organismu se nachází v interfázi, mimo období dělení, kdy jsou chromozomy nahloučené v buněčném jádře a není možné je od sebe oddělit.

Izolaci chromozomů ztěžuje také pevná buněčná stěna rostlinných buněk, která brání jejich uvolnění do roztoku. Dosud jedinou metodu, která tyto potíže překonává a je vhodná i pro rutinní aplikace, jsme vyvinuli v Centru strukturní a funkční genomiky rostlin ÚEB AV ČR v Olomouci. Chromozomy se izolují z buněk kořenového meristému semenáčků, kde je hodně buněk ve fázi dělení a buněčné stěny nejsou ještě plně vyvinuty. Na kořenové špičky se nechají působit látky, které donutí i více než polovinu buněk meristémů dělit se ve stejný okamžik. V tomto stádiu, kdy se chromozomy nacházejí mimo jádro v cytoplazmě, jsou kořenové špičky fixovány formaldehydem a chromozomy uvolněny do roztoku mechanickou homogenizací kořenů. Tento postup byl dosud optimalizován pro více než dvacet druhů rostlin a DNA takto izolovaných chromozomů je vhodná pro všechny známé aplikace molekulární biologie a genomiky.

Chromozomová genomika tedy představuje soubor mnoha technik a vyžaduje koordinovanou práci týmu specialistů zvládajících metody buněčné biologie, molekulární cytogenetiky, cytometrie, molekulární biologie a genomiky. Olomoucké pracoviště jako jediné na světě takový tým má. Díky tomu se podílí na významných mezinárodních projektech čtení genomu rostlin. Možnost třídit vybrané chromozomy je samozřejmě využívána i při řešení vlastních projektů. Rovněž se pokračuje ve vývoji nových aplikací založených na izolaci chromozomů pomocí průtokové cytometrie. Nejnovějšími z nich jsou sekvenování DNA získané z jediné kopie chromozomu a charakterizace proteinového složení chromozomů pomocí proteomických metod. Konečným cílem je nejen sekvenovat DNA chromozomů, ale také odhalit, jak je dědičná informace v chromozomech uspořádána a jak její funkci ovlivňují ostatní součásti vysoce organizované a složité struktury buněčného jádra, jehož podstatnou část tvoří chromozomy. Díky těmto poznatkům bude možné nejen odhalit molekulární podstatu procesů, které řídí růst a vývoj organismů a jejich reakci na faktory vnějšího prostředí, ale také tyto procesy cíleně ovlivňovat bez negativních důsledků pro ostatní funkce organismu.

• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

undefined

Autor:
prof. Ing. Jaroslav Doležel, DrSc. (Centrum strukturní a funkční genomiky rostlin,
Ústav experimentální botaniky AV ČR;
dolezel@ueb.cas.cz)

• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •