CO VŠECHNO NÁM MOHOU ŘÍCI CYTOMETRICKÉ ANALÝZY?


Obr. 1: Díky cytometrickým poznatkům bylo možné spolehlivě odlišit endemit Slavkovského lesa rožec kuřičkolistý (C. alsinifolium) od jeho křížence s r. rolním (C. arvense) a vybrat tak ochranářsky nejcennější populace

Obr. 2: Poprvé se mezidruhovou hybridizaci podařilo kriticky zhodnotit i u hvozdíku písečného českého (D. arenarium subsp. bohemicus)

Obr. 3: Pětiprstky (Gymnadenia) jsou v naší květeně rekordmany v počtu různých cytotypů (až 5) rostoucích v jedné populaci

Průtoková cytometrie je moderní cytogenetická technika, která slouží k velice rychlé analýze nejrůznějších chemických a/nebo fyzikálních vlastností buněk či buněčných organel. V botanickém výzkumu je nejčastěji využívána ke stanovení množství jaderné DNA (velikosti genomu). Spektrum cytometrických aplikací je velice široké a pokrývá rostlinnou biosystematiku (odlišení blízce příbuzných druhů, prokázání hybridizace, odhalení skryté diverzity), ekologii (studium rozšíření a ekologie různých ploidií či jejich vztahů s dalšími skupinami organizmů) i reprodukční biologii. Praktické uplatnění nachází průtoková cytometrie na poli ochrany přírody a ve šlechtitelství.

Valná většina krytosemenných rostlin je polyploidních – jejich buňky tedy obsahují více než 2 kopie každého chromozómu. Polyploidní komplexy často bývají taxonomicky obtížné (jednotlivé druhy jsou si morfologicky podobné) a ploidní stupeň u nich bývá tím nejspolehlivějším vodítkem při určování. Z naší květeny můžeme jmenovat například skupinu rozrazilu břečťanolistého (Veronica hederifolia agg.), svízele bílého (Galium album agg.) nebo šichy černé (Empetrum nigrum agg.). Jednoznačné určení kříženců v takových skupinách často leží mimo možnosti klasické morfologické systematiky a znalost ploidie se stává nezbytnou podmínkou při podezření na hybridizaci. Díky průtokové cytometrii byli poprvé odhaleni kříženci např. u klikev (Vaccinium sect. Oxycoccus) nebo pitulníků (Lamium subg. Galeobdolon).

V minulosti se soudilo, že každý rostlinný druh může mít jen jedinou ploidní úroveň (cytotyp). Cytometrie však výrazně posunula naše znalosti této problematiky a odhalila, že u mnoha rostlin se vyskytuje několik různých cytotypů. Například populace ohrožených orchidejí z rodu pětiprstka (Gymnadenia, obr. 3) mohou být tvořeny až 5 různými ploidními úrovněmi, přičemž tato variabilita nemusí vždy korelovat s velikostí dané populace. Popsaná skrytá (kryptická) diverzita je tedy důležitá pro výběr ochranářsky nejcennějších lokalit, bez použití průtokové cytometrie by však zůstala neodhalena. Aktuální projekty Botanického ústavu AV ČR zaměřené na poznání skryté diverzity probíhají i mimo území naší republiky, např. v jedné z nejbohatších flór vůbec – jihoafrické kapské květenné oblasti.

Průtoková cytometrie umožňuje měřit velikost genomu i v absolutních jednotkách (např. pikogramech DNA; 1 pg = 10-9 g).

Rostliny se obecně vyznačují obrovskou (více než 2 400násobnou) variabilitou v obsahu jaderné DNA – najdeme zde „trpaslíky“, jejichž genom je zhruba 50× menší než genom člověka, ale i „obry“, které obsahem DNA člověka 50× převyšují. Samotná velikost genomu (bez ohledu na konkrétní nesenou genetickou informaci) může ovlivňovat různé ekologické (např. odolnost k mrazu, rychlost ontogeneze, pravděpodobnost invazního chování) či fenologické charakteristiky (např. nástup kvetení). Uvedená zjištění lze tedy využít při odhadu vlastností dosud podrobně nestudovaných druhů. Například v invazní biologii může množství jaderné DNA sloužit k posouzení rizika, zda se určitý rostlinný druh může stát invazním. Jsou popsány i případy, kdy na základě rozdílného obsahu DNA byly objeveny nové, dosud přehlížené druhy, a teprve dodatečně u nich byly zjištěny též rozdíly v morfologii nebo ekologii. Díky tomu, že cytometrické analýzy lze provádět s nepatrným množstvím rostlinného materiálu, je tato metoda velmi vhodná pro podrobné studium vzácných a chráněných druhů. Cytometrie tak kupříkladu vyřešila téměř století trvající spor týkající se hybridizace mezi „vlajkovým“ endemitem naší květeny (tj. druhem rostoucím na celém světě pouze v ČR), rožcem kuřičkolistým (Cerastium alsinifolium, obr. 1 ) a jeho hojným příbuzným r. rolním (C. arvense). Studie přinesla značně překvapivé výsledky a ukázala, že v centru ochranářského zájmu dosud stáli kříženci, zatímco vlastní endemit byl chráněn jen okrajově. Podobně se cytometrie osvědčila i při studiu hybridizace dalšího endemického zástupce naší květeny, hvozdíku písečného českého (Dianthus arenarius ssp. bohemicus, obr. 2 ) z Podřipska.

Zcela jedinečnou aplikaci průtokové cytometrie představuje stanovení reprodukčního způsobu na základě určení ploidie embrya a endospermu u zralých semen. Je známo, že kromě klasického pohlavního rozmnožování mohou semena vznikat i samovolně bez účasti otcovské rostliny (apomixie), svoji roli mohou hrát také neredukovaná vajíčka či pylová zrna. Apomikticky se rozmnožující rostliny představují cenný materiál např. ve šlechtitelství a zemědělství pro produkci geneticky uniformních jedinců pomocí semen. Intenzivní výzkumy probíhají u obilnin, např. rýže či kukuřice, jejíž divoký předek je apomiktický. Jako typickou apomiktickou modelovou rostlinu si ještě uveďme pampelišku (Taraxacum). U ní byla, i díky výzkumu probíhajícím v BÚ AV ČR, ukázána genetická nezávislost hlavních složek apomiktického reprodukčního způsobu. A to za pomoci průtokové cytometrie. A ve šlechtitelství ještě zůstaneme, neboť cytometrie je zde často využívána k selekci jedinců s požadovanými vlastnostmi (např. polyploidi často vykazují vyšší vzrůst či větší výnosy), výběru hybridních rostlin kombinujících charakteristiky rodičů nebo při kontrole čistoty osiva. Speciální kapitolu pak představuje aplikace cytometrie při sekvenování velkých genomů (např. pšenice). Značná velikost genomu pšenice (více než 17 miliard párů bází) nedovoluje osekvenovat celý genom najednou. Problém lze elegantně překonat rozdělením genomu na jednotlivé chromozómy (pomocí cytometrického třídění) a teprve ty pak podrobit sekvenování.

Nastíněné příklady ukazují, že průtoková cytometrie nabízí jedinečný způsob, jak elegantně nahlédnout do „soukromí“ rostlin. Prakticky s jistotou můžeme předpokládat, že zapojení této metody v biosystematických a evolučních studiích bude do budoucna stoupat a četné pozoruhodné objevy na sebe nenechají dlouho čekat.

• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

Kontakt:
Doc. RNDr. Jan Suda, Ph.D. (suda@natur.cuni.cz; Laboratoř průtokové cytometrie),
Mgr. Ing. Pavel Trávníček, Ph.D. (travnicek@ibot.cas.cz
; Oddělení průtokové cytometrie),
Mgr. Jana Kalůsková (Jana.Kaluskova@seznam.cz
; Oddělení průtokové cytometrie)

Více informací o tématu:
Doležel J., Greilhuber J. & Suda J., eds.: Flow Cytometry with Plant Cells. Analysis of Genes, Chromosomes and Genomes (2007)

Pozn.: PDF nemusí být správně zobrazeno v některých internetových prohlížečích (např. Mozilla).
Pro správné zobrazení otevřete soubor v programu Adobe Reader.

• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •